Conjugación FITC Protocolos

isotiocianato de fluoresceína, comúnmente conocida como FITC - pronunciado "encajar-c," a la rima con "ditsy" - es un marcador fluorescente que es unida químicamente, o conjugados, con otras moléculas tales como proteínas y anticuerpos. Un anticuerpo conjugado con FITC también puede ser referido como un "anticuerpo marcado con FITC." FITC es excitado por la luz a una longitud de onda de 488 nm y emite energía de fluorescencia detectada a 530 nm. Un científico puede verlo con un equipo de microscopio o el uso fluorescente que detecta las emisiones fluorescentes y las graba.

métodos

FITC conjugación sigue un protocolo básico. Por ejemplo, FITC y un anticuerpo se mezclan juntos a una determinada relación en un tubo de ensayo y girar a temperatura ambiente durante una hora. Para retirar el no unido FITC de la solución, se vierte sobre una columna de cromatografía de afinidad - un tubo de vidrio lleno de un gel de talones como que se unirá el conjugado FITC. Mientras tanto, el anticuerpo marcado con FITC fluirá a través de la columna y se recoge para su uso.

consideraciones

Antes de iniciar una conjugación, el investigador debe tener en cuenta varios puntos. En primer lugar, FITC es muy inestable y no se debe exponer a la luz - se debe tener en tubos de papel de aluminio cubierto en todo momento. En segundo lugar, el tiempo de conjugación y la temperatura pueden tener que ser alterado para una proteína sensible a la temperatura. Finalmente, las diferentes proteínas y anticuerpos pueden tener diferentes capacidades de unión a FITC, por lo que encontrar la proporción correcta de anticuerpo a FITC es crítica; demasiado poco FITC hace un anticuerpo indetectable y en exceso puede alterar su especificidad. Por esta razón, las conjugaciones preliminares a pequeña escala en diferentes proporciones de FITC a anticuerpos deben establecerse en paralelo. Una vez establecida la relación óptima, la conjugación a gran escala se puede realizar.

Usos

Los médicos y científicos usan anticuerpos marcados con FITC, hormonas y factores de crecimiento en una amplia variedad de ensayos y aplicaciones. Por ejemplo, una célula madre que se encuentra en la sangre tiene una molécula en su superficie llamada CD34. Un técnico de laboratorio puede mezclar la sangre de un paciente con un anticuerpo marcado con FITC específico para CD34, y ejecutar las células a través de un citómetro de flujo que utiliza un rayo láser para hacer la fluorescencia FITC. A continuación, el citómetro separa las células CD34 fluorescentes de el resto de las células de la sangre, y los médicos pueden usar estas células madre aisladas para tratamientos terapéuticos.